核酸檢測PCR實驗室的建設(shè)規(guī)范及要點說明
新冠疫情暴發(fā)以后，國家對生物安全問題的重視程度越來越高，目前，生物安全已經(jīng)上升到國家高度，其已納入國家安全體系，系統(tǒng)規(guī)劃國家生物安全風(fēng)險防控和治理體系建設(shè)，全面提高國家生物安全治理能力迫在眉睫。2020年10月17日《中華人民共和國生物安全法》正式發(fā)布，自2021年4月15日起施行，其中對于病原微生物實驗室生物安全做出了詳細(xì)的規(guī)定。
醫(yī)院諸多實驗室活動會涉及到生物安全問題，尤其是針對新冠病毒核酸檢測活動，基本上為目前生物安全要求最高的診斷工作。生物安全對醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)的重要性可見一斑，因此，為進一步加強醫(yī)院實驗室生物安全管理工作，2020年10月16日國家衛(wèi)健委開始牽頭組織修訂《病原微生物實驗室生物安全管理條例》。
醫(yī)院實驗室簡介
醫(yī)院很多診斷基于各類實驗進行支持活動，這些實驗活動一般在檢驗科和病理科的醫(yī)學(xué)實驗室進行，醫(yī)學(xué)實驗室活動如涉及生物安全問題，則必須符合相應(yīng)等級的生物安全實驗室標(biāo)準(zhǔn)。
WS/T 422-2014《臨床實驗室生物安全指南》將“臨床實驗室”定義為：對取自人體的各種標(biāo)本進行生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、血液免疫學(xué)、血液學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等檢驗，并為臨床提供醫(yī)學(xué)檢驗服務(wù)的實驗室。
GB/T 22576-2008《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力的專用要求》將“醫(yī)學(xué)實驗室”定義為：以為診斷、預(yù)防、治療人體疾病或評估人體健康提供信息為目的，對來自人體的材料進行生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、血液免疫學(xué)、血液學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)或其他檢驗的實驗室，實驗室可以提供其檢查范圍內(nèi)的咨詢服務(wù)，包括解釋結(jié)果和為進一步的適當(dāng)檢查提供建議。
上述兩個標(biāo)準(zhǔn)的定義對于醫(yī)學(xué)實驗室和臨床實驗室基本相同，醫(yī)學(xué)實驗室和臨床實驗室為同一種實驗室。
《病原微生物實驗室生物安全管理條例》將“病原微生物實驗室”定義為：從事與病原微生物（能夠使人或者動物致病的微生物）菌（毒）種、樣本有關(guān)的研究、教學(xué)、檢測、診斷等活動的實驗室。
病原微生物危害程度分類：根據(jù)病原微生物的傳染性、感染后對個體或者群體的危害程度，將病原微生物分為四類：
表1 病原微生物的分類
| 名稱 | 定義 |
| 第一類病原微生物 | 是指能夠引起人類或者動物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。 |
| 第二類病原微生物 | 是指能夠引起人類或者動物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。 |
| 第三類病原微生物 | 是指能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險有限，實驗室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。 |
| 第四類病原微生物 | 是指在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。 |
注1：第一類、第二類病原微生物統(tǒng)稱為高致病性病原微生物。
醫(yī)院從事病原微生物實驗活動必須在符合相應(yīng)等級的生物安全實驗室內(nèi)進行。GB50346-2011《生物安全實驗室建筑技術(shù)規(guī)范》將“生物安全實驗室”定義為：通過防護屏障和管理措施，達到生物安全要求的微生物實驗室和動物實驗室。包括主實驗室及其輔助用房。
生物安全實驗室根據(jù)所操作致病性生物因子的傳播途徑可分為a類和b類。
表2 生物安全實驗室的分類
| 名稱 | 定義 | |
| a | 指操作非經(jīng)空氣傳播生物因子的實驗室 | |
| b | _ | 指操作經(jīng)空氣傳播生物因子的實驗室 |
| b1 | 指可有效利用安全隔離裝置進行操作的實驗室 | |
| b2 | 指不能有效利用安全隔離裝置進行操作的實驗室 |
實驗室生物安全防護水平分級：根據(jù)對所操作生物因子采取的防護措施，將實驗室生物安全防護水平分為一級、二級、三級和四級，一級防護水平最低，四級防護水平最高，依據(jù)國家相關(guān)規(guī)定。
表3 生物安全實驗室的分類
| 實驗室簡稱 | 適用范圍 | 簡稱 | 備注 |
| 生物安全防護水平為一級的實驗室 | 適用于操作在通常情況下不會引起人類或者動物疾病的微生物。 | P1、BSL-1實驗室 | _ |
| 生物安全防護水平為二級的實驗室 | 適用于操作能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環(huán)境不構(gòu)成嚴(yán)重危害，傳播風(fēng)險有限，實驗室感染后很少引起嚴(yán)重疾病，并且具備有效治療和預(yù)防措施的微生物。 | P2、BSL-2實驗室 | _ |
| P2+、加強型BSL-2實驗室 | 通過機械通風(fēng)系統(tǒng)等措施加強實驗室生物安全防護要求的實驗室 | ||
| 生物安全防護水平為三級實驗室 | 適用于操作能夠引起人類或者動物嚴(yán)重疾病，比較容易直接或者間接在人與人、動物與人、動物與動物間傳播的微生物。 | P3、BSL-3實驗室 | _ |
| 生物安全防護水平為四級實驗室 | 適用于操作能夠引起人類或者動物非常嚴(yán)重疾病的微生物，以及我國尚未發(fā)現(xiàn)或者已經(jīng)宣布消滅的微生物。 | P4、BSL-4實驗室 | _ |
其中以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示僅從事體外操作的實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平。以ABSL-1（Animal Biosafety Level 1, ABSL-1）、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示包括從事動物活體操作的實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平。
二、新冠肺炎核酸檢測PCR實驗室
通常醫(yī)院檢驗科和病理科等科室使用的實驗室為生物安全二級（BSL-2）實驗室。但新冠病毒核酸檢測用PCR實驗室則不同，《醫(yī)療機構(gòu)發(fā)熱門診臨床實驗室能力建設(shè)專家共識（2020 版）》說明：對于用于新冠病毒檢測的PCR實驗室（以下簡稱“PCR實驗室”）選址宜設(shè)置在發(fā)熱門診內(nèi)，且建筑標(biāo)準(zhǔn)宜滿足加強型醫(yī)學(xué)BSL-2實驗室標(biāo)準(zhǔn)。
《醫(yī)學(xué)生物安全二級實驗室建筑技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》T/CECS 662-2020則對加強型醫(yī)學(xué)BSL-2實驗室建筑技術(shù)要求進行了規(guī)定?！夺t(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室工作導(dǎo)則》對PCR實驗室布局和流程進行了明確規(guī)定。
《關(guān)于印發(fā)醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)檢驗實驗室建筑技術(shù)導(dǎo)則（試行）的通知》則對檢驗實驗室建筑技術(shù)做出了整體要求。下面結(jié)合上述四部規(guī)范相關(guān)要求和實際建設(shè)的PCR實驗室案例對建設(shè)要點進行梳理。
1、PCR實驗室應(yīng)合理選址和布局
《醫(yī)療機構(gòu)發(fā)熱門診臨床實驗室能力建設(shè)專家共識（2020 版）》要求，對于用于新冠病毒檢測的PCR實驗室應(yīng)設(shè)置在檢驗科中心實驗室和急診實驗室以外的區(qū)域，宜在發(fā)熱門診區(qū)域內(nèi)，同時，應(yīng)自成一區(qū)，宜設(shè)置在建筑的一端。
實驗室防護區(qū)應(yīng)包括主實驗室、緩沖間、防護服更換間等，輔助工作區(qū)應(yīng)包括清潔衣物更換間、淋浴間等。
PCR實驗室平面布局一般可分為 “四區(qū)”，即試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)。結(jié)合實際，可采用集中布置或分散布置形式，并配套設(shè)置洗消設(shè)施。
當(dāng)采用實時熒光定量PCR儀時，核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一區(qū)。當(dāng)采用一體化自動化核酸分析設(shè)備時，樣本制備區(qū)、核酸擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并為一區(qū)。
《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南（第四版）》指出，新冠病毒核酸檢測方法主要是實時熒光RT-PCR方法，所以用于新冠病毒檢測的PCR實驗室可以設(shè)置為 “三區(qū)”。
▲ 圖1 “三區(qū)”的PCR實驗室布局設(shè)計
2、PCR實驗室應(yīng)合理規(guī)劃檢驗人員
PCR實驗室標(biāo)本制備室的生物安全要求最高，檢驗人員進入該區(qū)域緩沖間前需要在更衣室穿防護服，實驗結(jié)束后在緩沖間脫掉防護服，因此需要設(shè)置更衣室和合理規(guī)劃進出實驗室動線。
為提高效率，咽拭子標(biāo)本宜設(shè)置可直接進入標(biāo)本制備室的運輸動線，同時標(biāo)本傳遞口應(yīng)設(shè)置傳遞窗。
根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎疫情醫(yī)療廢物應(yīng)急處置管理與技術(shù)指南（試行）》要求，有條件的醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)可對肺炎疫情防治過程產(chǎn)生的感染性醫(yī)療廢物的暫時貯存場所實行專場存放、專人管理，不與其他醫(yī)療廢物和生活垃圾混放、混裝。
因此，針對標(biāo)本制備室高壓滅菌消毒后的污物，應(yīng)規(guī)劃污物運輸動線和相對獨立的暫存間。
▲ 圖2 PCR實驗室平面圖（布局、分區(qū)和動線）
3、PCR實驗室氣流組織應(yīng)符合定向氣流原則
氣流組織應(yīng)有利于室內(nèi)氣流由被污染風(fēng)險低的空間向被污染風(fēng)險高的空間流動，最大限度減少室內(nèi)回流與渦流。通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)應(yīng)保證各工作區(qū)的空氣不產(chǎn)生交叉污染。
實驗室的空氣流向可按照試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行，防止擴增產(chǎn)物順空氣氣流進入擴增前的區(qū)域。
▲ 圖3 PCR實驗室平面圖（風(fēng)險區(qū)域劃分）
4、試劑準(zhǔn)備區(qū)為正壓
試劑準(zhǔn)備區(qū)主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。因此，該區(qū)并不產(chǎn)生污染源，但須確保試劑免受外界污染，該區(qū)相對緩沖間和標(biāo)本制備室應(yīng)設(shè)置為正壓。
5、標(biāo)準(zhǔn)制備區(qū)要保持負(fù)壓
標(biāo)本制備區(qū)為實驗室核心工作區(qū)，其主要進行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管和測定RNA時cDNA的合成。取樣時病毒還未滅活，且在取樣操作時，容易造成氣溶膠擴散。
《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第七版）》指出，新冠病毒的主要傳播途徑為經(jīng)呼吸道飛沫和接觸傳播，在相對封閉的環(huán)境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經(jīng)氣溶膠傳播的可能。
因此，為保護人員安全，必須在生物安全柜內(nèi)操作，防止標(biāo)本氣溶膠的擴散。此后，標(biāo)本經(jīng)過滅活處理，使病毒蛋白不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力，使操作人員在對樣本進行檢測時相對安全，但是病毒蛋白的基因序列并沒有受到影響。
因此，后續(xù)操作時主要防止含有病毒核算的氣溶膠污染造成“假陽性”現(xiàn)象。因此，該區(qū)會產(chǎn)生污染源物，該區(qū)對緩沖間和試劑準(zhǔn)備室保持負(fù)壓，負(fù)壓值小于擴增分析室。
6、擴增分析區(qū)負(fù)壓值最高
擴增分析區(qū)主要進行的操作為DNA或cDNA擴增和擴增片段的測定。操作過程中，要防止含病毒核酸的氣溶膠通過開門卷吸等途徑，擴散出去對試劑與標(biāo)本造成污染，造成“假陽性”現(xiàn)象。所以擴增分析區(qū)對緩沖間和標(biāo)本制備室應(yīng)設(shè)置保持負(fù)壓，且該區(qū)為實驗室負(fù)壓最大的房間。
7、關(guān)于通風(fēng)系統(tǒng)的設(shè)置
對于標(biāo)本制備室采用的生物安全柜宜設(shè)置ⅡA2型生物安全柜，在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠操作地點的上方附近不應(yīng)設(shè)送風(fēng)口，不宜設(shè)置可開啟門的正對面方向。
機械通風(fēng)系統(tǒng)時應(yīng)避免交叉污染，排風(fēng)機應(yīng)設(shè)置在排風(fēng)管路末端，排風(fēng)應(yīng)設(shè)置高效過濾器，并通過獨立于建筑物其他公共通風(fēng)系統(tǒng)的管道排出。
PCR實驗室宜采用全新風(fēng)直流式空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)，可降低空調(diào)系統(tǒng)“藏毒”風(fēng)險。各區(qū)工作間不應(yīng)設(shè)置可開啟外窗，入口應(yīng)設(shè)置緩沖間,當(dāng)緩沖間的門設(shè)置互鎖時，應(yīng)在互鎖門的附近設(shè)置緊急手動解除互鎖開關(guān)。應(yīng)在合適位置設(shè)測壓孔，并采用密封措施。在入口處宜安裝空氣壓力顯示裝置，量程應(yīng)與實驗室靜壓差相匹配?？稍O(shè)置自動報警功能。
表4 加強型醫(yī)學(xué)BSL-2標(biāo)準(zhǔn)PCR實驗室主要技術(shù)要求和指標(biāo)
| 技術(shù)要求 | 指標(biāo) |
| 通風(fēng)方式 | 機械通風(fēng)，不應(yīng)自然通風(fēng)；且不宜使用循環(huán)風(fēng) |
| 緩沖間 | 應(yīng)設(shè)置 |
| 核心工作間相對于相鄰區(qū)域最小負(fù)壓（Pa） | 不宜小于-10Pa |
| 高效過濾排風(fēng) | 有 |
| 高效過濾送風(fēng) | 宜設(shè)置 |
| 溫度（℃） | 18～26 |
| 相對濕度（%） | 30～70 |
| 噪聲[DB(A)] | ≤60 |
| 核心工作間平均照度[lx] | ≥300 |
PCR實驗室應(yīng)保證用電的可靠性，用電負(fù)荷等級、自動恢復(fù)供電時間的確定應(yīng)符合現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。離心機電源宜與重要儀器設(shè)備分開接線。重要儀器設(shè)備應(yīng)配備不間斷電源，當(dāng)設(shè)置不間斷電源（UPS）時，工作時間不宜小于30min。標(biāo)本制備區(qū)或者消毒間內(nèi)需配備壓力蒸汽滅菌器以及其他適用的消毒設(shè)備，用于穿過的防護服和用過的咽拭子樣本瓶等污染物品消毒，因此設(shè)計時應(yīng)預(yù)留大功率電源。設(shè)置紫外線消毒燈具時，燈具距地1.8～2.2m,控制開關(guān)應(yīng)設(shè)置在消毒區(qū)域之外，控制開關(guān)的面板形式或顏色宜區(qū)別于普通照明開關(guān)，安裝高度宜距地1.8m以上，防止誤操作。
PCR實驗室應(yīng)設(shè)置緊急噴淋裝置和洗眼器裝置。每個房間的出口處均應(yīng)設(shè)置非手動開關(guān)的洗手池（如腳踏式或感應(yīng)式），給水管不應(yīng)與衛(wèi)生器具、實驗設(shè)備直接連接，應(yīng)設(shè)置空氣隔斷或倒流防止器，并為后期檢修、更換預(yù)留條件。